Современное оборудование
для лаборатории
620028, г. Екатеринбург, ул. Кирова, д.28/1
medica.group@uphc.ru
пн-пт: с 9:00 до 18:00

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Посев бактерий при помощи шпателяПосев бактерий с помощью шпателя производят в такой последовательности:

  • При помощи стерильной пипетки на поверхность питательной среды в одной чаше наносят каплю накопительной культуры и распределяют ее шпателем.
  • Шпатель быстро достается и без стерилизации переносится во вторую чашу. Инструментом имитируют распределение культуры по поверхности чаши.
  • Процедуру, проделанную со второй чашей, повторяют с третьей чашей.  После этого шпатель стерилизуют.

Инструмент из металла прокаливают на огне. Стеклянный шпатель помещают в дезинфицирующее средство. Засеянные чаши отправляют в термостат.

Через определенный отрезок времени чаши достают и изучают процесс роста микроорганизмов. В первой чаше обычно наблюдается сплошной рост бактерий. В двух других – изолированные колонии.

При использовании для посева тампона. На него наносят исследуемый материал. После тампон помещают в чашу и круговыми движениями втирают содержимое в поверхность питательной среды.

При использовании секторного посева дно чаши предварительно разделяют на сектора, после чего высевают микроорганизмы зигзагообразными движениями в направлении от краев чаши к центру. Стараясь наносить так, чтобы сектора не пересекались.

Газонный посе вбактерийГазонный посев – более сложная технология. На поверхность среды наносят около 1 мл исследуемого материала. Это может быть культура в виде жидкого бульона, или взвесь микроорганизмов, помещенных в физиораствор. После нанесения жидкость тщательно распределяют по всей поверхности. А для удаления избытков используют пипетку. Удаленный субстрат вместе с пипеткой после помещается в дезинфицирующий раствор.

После посева чаши закрывают и переворачивают, а на дно наносят необходимые для идентификации надписи.

Если посев производится из пробирки в пробирку, то емкости держат под наклоном, так чтобы их края были на одном уровне. Бактериальную петлю вертикально прокалывают в пламени горелки. В пробирку прокаленную петлю вводят через пламя горелки. При выполнении посева на жидкую среду петлю слегка погружают в нее, а сам посевной субстрат растирают по стенкам пробирки, а после смывают средой.

Посев жидкого материала можно выполнять при помощи стерильной пипетки.

Посев на скошенный агар-агар выполняют штрихообразными движениями, начиная с конденсационной воды. Если состав залит столбиком, то его посев выполняют уколом.

После посева петля достается из пробирки. Пробирка плотно закрывается и проводится через пламя горелки. Петля также прокалывается.

Когда проводится выделение чистых культур аэробов, то при посеве можно использовать не только методы механического разобщения, но и варианты, учитывающие различие бактерий по биологическим свойствам. Например, некоторые из них могут распространяться на немного влажной поверхности, что позволяет эффективно разделять подвижные и неподвижные микробы.

При культивации могут использоваться и специальные вещества, подавляющие рост определенных микробов. Например, за счет добавления нистатина можно очищать бактериальные культуры от грибов.

Для получения изолированных колоний время пребывания посевов в термостате составляет от 18 до 24 часов.

Колония – популяция клеток микробов одного вида, которые сформированы в результате деления одной клетки в условиях культивирования, с применением плотной питательной среды в оптимальных температурных условиях.

Изолированные колонии отвивка чистых культур

Изучение изолированных колоний осуществляется на втором этапе исследований.

Их строение – важный культуральный признак, позволяющий определить вид микроорганизмов за счет типичности, которая присуща определенным колониям при росте. Изучение колоний осуществляется невооруженным взглядом в проходящем и отраженном свете. Для этого используется лупа или микроскоп с небольшим увеличением.

Изучение изолированных колонийОсновные признаки, упитывающиеся при описании колоний:

  • Форма. Она может быть круглой, неправильной, ризоидной, в форме амебы и т.д.
  • Размер или диаметр. Мелкие колонии, или точечные, в диаметре составляют от 0,1 до 0,5 мм, мелкие - от 0,5 до 3 мм, средние могут быть от 3 до 5 мм, а диаметр крупных бывает боле 5 мм.
  • Тип поверхности. Различают колонии с гладкой поверхностью, шероховатой, складчатой, морщинистой, радиально исчерченные и с концентрическими кругами.
  • Тип профиля. Он может быть плоским, выпуклым, кратерообразным и т.д.
  • Прозрачность колонии. Бывает матовой, тусклой, прозрачной, мучнистой.
  • Цвет или пигмент. Колонии делятся на бесцветные или пигментированные (белые, желтые, золотистые, красные, черные).
  • Особенности краев. Могут быть ровными, зубчатыми, волнистыми и т.д.
  • Структура колоний бывает однородной, мелкозернистой, крупнозернистой.

Определить консистенцию колонии можно прикоснувшись к ее поверхности петлей. По этому параметру различают колонии с плотной и мягкой консистенцией, слизистой и хрупкой.

Типы бактериальных колонийСуществует два основных типа бактериальных колоний:

  1. S – тип или гладкие колонии. Они отличаются круглой или выпуклой формой, имеют гладкую поверхность и влажную консистенцию.
  2. R – тип или шероховатые колонии. Имеют шероховатую поверхность и неровные края неправильной формы, а также сухую консистенцию. Происходят от предыдущих форм в процессе мутации.

Существует так же слизистый тип колоний – M. У него тягучая слизистая консистенция.

При выполнении посева штрихом из части изученной колонии готовят мазок, который окрашивают и микроскопируют. Если при проведении последней операции происходит повреждение однородности состава колонии, то оставшуюся часть отвивают на скошенный агар-агар.

Рост микроорганизмов в жидких средах сопровождается помутнением состава, образованием осадка или пленки. У каждого типа роста есть свои специфические особенности:

  • Культивация факультативных анаэробов обычно сопровождается равномерным помутнением различной степени.
  • При придонном росте бактерий обычно образуется осадок различного типа и объема – скудный, обильный, рыхлый или слизистый, с хлопьями или зернами. При этом сама питательная среда может мутнеть или оставаться прозрачной.
  • При пристеночном росте сама среда может оставаться прозрачной, а на поверхности стенок сосуда могут образовываться зерна, рыхлые хлопья.
  • При поверхностном росте в процессе культивации аэробных бактерий на поверхности может образовываться пленка различного типа – сухая, плотная, складчатая и т.д.

Биохимические свойства выделенных микроорганизмов

На третьем этапе изучают свойства полученных при культивации микроорганизмов, обращая внимание на их форму, величину и расположение клетки. При помощи использования специального окрашивания можно выявить споры и жгутики, капсулы и включения.

Дополнительную идентификацию проводят и по другим признакам – биохимическим, антигенным и т.д.

Определение протеолитических свойств

Эти свойства характеризуют способность микроорганизмов расщеплять белки. Их изучают при исследовании сред на основе желатина, молока, пептона и других. Мясо-пептонную желатину стерилизуют и посев выполняют при помощи укола. Культивирование проводится в течение 7-10 суток в условиях комнатной температуры. После чего определяют разжижение без дополнительных приспособлений, т.е. визуально. При наличии разжижения указывают его форму и интенсивность.

При ферментации пептонов образуется индол, аммиак, сероводород и другие соединения.

Чтобы обнаружить сероводород, после посева под пробирку помещают специальную бумагу, которая пропитана раствором уксусного свинца. На наличие сероводорода индикаторная бумага укажет почернением.

Чтобы выявить индол индикаторную бумагу покрывают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага краснеет при наличии индола. Для выявления индола можно использовать и реактив Эрлиха.

Для определения аммиака используют увлажненную красную лакмусовую бумажку, которая при идентификации синеет.

Определение сахаролитических свойств

Некоторые среды способны разлагать сахара и многоатомные спирты. При этом образуются кислоты, а иногда и газы. Обычно эту способность изучают на средах Гисса. В их состав входит пептонная вода, многоатомные спирты, индикатор. Окраска среды меняется под воздействием разлагающегося углевода кислоты. На газообразование указывает наличие пузырьков.

Сахаролитические свойства изучают и на других средах - Эндо, Левина, Плоскирева. В их составе присутствует молочный сахар.

Определение ферментов микробов

Для биохимической деятельность необходимо ферментативная деятельность. Ферменты выступают биологическими катализаторами, которые определяют метаболические процессы. Микроорганизмы могут отличаться по набору ферментов, которые они способны синтезировать.

Каталаза – фермент разложения перекиси водорода, при которой происходит образование воды и кислорода. Обнаружить каталазу можно по выделяющимся после смешивания микробных клеток с перекисью водорода пузырькам. Оксидазу определяют несколькими способами. Один из них происходит с применением 1% водного раствора диметилпарафенилендиамина.

Реактив Ковача

Используется при диффузном методе определения ферментов. Этот экспресс метод может применятся при поиске активных продуцентов ферментов в популяциях природного происхождения. Суть метода состоит в следующем: берут 3% раствор агар-агара и смешивают с таким е объемом субстрата, полученный состав помещают в чаши Петри. В застывшем агаре делают лунки, которые наполняют раствором фермента. После этого определяют зоны превращения субстрата.

Обнаружение амилазы

Используют 1,6% раствор крахмала, который кипятят 3 минуты при постоянном помешивании. Его смешивают в равных долях с ацетатным буфером. Окрашивание раствором Люголя 1 минуту.

Обнаружение липаз

Используют субстраты на основе фосфатного буфера с pH 7,6. Его смешивают с равным количеством горячего агар-агара и добавляют 0,1% подсолнечного масла. После перемешивания в гомогенизаторе в течение 1 минуты состав разливают в чаши. Активность определяется по наличию зоны просветления по краю лунки.

Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.

Поделиться ссылкой:

 

Вернуться назад