Современное оборудование
для лаборатории
620028, г. Екатеринбург, ул. Кирова, д.28/1
medica.group@uphc.ru
пн-пт: с 9:00 до 18:00

Культивирование вирусов в питательных средах

Культивирование вирусов представляет собой их выращивание в искусственных условиях. Для этого культиваторы заражают животных, либо ткани и клетки. Такое мероприятие проводят в целях диагностики, при проведении экспериментов, с целью изготовления противовирусных вакцин.

Культивирование вируса впервые было совершено Гальтье в 1879 году. Он культивировал вирус бешенства, заразив мозг кролика вирусом бешенства, полученным у больной собаки. Ученым Левенштейном была обнародована информация о возможности передачи вируса герпеса от человека кролику.

Репродуцирование вирусом осуществляется исключительно в живых клетках. По этой причине для того, чтобы они накопились, их заражают вирусами. После заражения вирус адаптируется к новому организму. Адаптация вируса проходит тем легче, чем ближе новая среда.

Чтобы репродукция прошла на лучшем уровне используют чувствительную систему, а заражение проводят свежим, но разведенным материалом. Это объясняется тем, что инактивированный вирус может приостанавливать скорость размножения вирионов. Система, в которой осуществляется репродукция, называется пермиссивной. Но, однако для каждого вируса пермиссивная система может приобрести статус непермиссивной. Это будет возможно в случае изменения условий культивирования. К примеру, таким условием являются температурные скачки.

Культивирование вируса на животных осуществляется только в том случае, ели эти вирусы приводят к формированию ясной и понятной клинической картины, либо патологоанатомической картины. Например, во время заражения мышей вирусом бешенства у них случается паралич. Большое количество вирусов хорошо вырастают в птичьих эмбрионах либо теле новорожденных млекопитающих. Реже в организме половозрелых особей.

Культивируют вирус в организмах мышей, крыс, кроликов, кур. На взрослых особях мышей выращивают вирусы гриппа и бешенства.

На белых крысах и хомяках испытывают онкогенные вирусы. Вирус ящура и маргбурской болезни культивируют на морских свинках. Ученые смогли изучить вирусы полиомиелита и желтой лихорадки только после того, как изучили их рост на макаках.

Возбудителей некоторых инфекций ученые смогли определить только после заражения шимпанзе. К таковым относят вирусы гепатита А и В.

Чтобы ученые получили верные результаты все животные, в организме которых культивируют вирусы, должны быть генетически однородными. Для достижения этой цели осуществляют скрещивание лабораторных особей. Результатом такого действия становится растущая степень гомозиготности.  

Чтобы культивирование прошло успешно, мало выбора правильного вида и возраста животного. Очень важно, какой будет использован путь для введения материала. Чаще всего вирусы вводят в чувствительные ткани. Лишь малая часть вирусов патогенна для животных независимо от способов введения.

Большая часть нейротропных вирусов выращивают путем введения их в левое и правое полушарие головного мозга животных. Так происходит дело с культивированием вируса у мышей. Кроликам, мышам, овцам, собакам и другим животным аналогичным образом вводят вирус бешенства. Очень часто для культивирования вирусов использую и другой путь: через брюшную полость. Но по чувствительности такой способ уступает введению в головной мозг. Респираторные вирусы чаще вводят в организм интраназальным путем, то есть закапывают в нос или распыляют в виде аэрозоля.

На сирийских хомячках культивируют аденовирус. Вводят его под кожу или в слизистую. В мышцу, через рот, в вену и через анальное отверстие вирусы вводят изредка. Внутривенное заражение произвести с грызунами и другими маленькими животными очень сложно. Вместо этого вирусы вводят прямо в сердечную мышцу.

Осложняется культивирование вирусов в организме животных наличием внутри иных вирусов и бактерий. Иногда случается такое, что вирус в организме животного вырабатывает иммунитет к новому культивируемому.

Чтобы снизить вероятность загрязнения культивируемых вирусов для введения материала используют выращенных в изоляции животных. Для этого выбирают животных, у матерей которых нет в организме инфекций, передающихся от матери к плоду. Новорожденных детенышей извлекают из тела матери, вводят в кишечник специальные молочнокислые бактерии. Для вскармливания таких малышей необходимы SPF самки. Затем уже между такими животными размножение осуществляется тем же путем. Содержатся малыши в закрытых помещениях, в которых осуществляется подача воздуха, свежей пищи и воды.

Животные, в организме которых не имеется никаких возбудителей, содержатся в специально отведенных боксах, в строгой изоляции.

Для культивирования вирусов подходят эмбрионы птиц. Для того, чтобы получить нужные результаты, необходимо правильно выбрать особь, ее вид и возраст, путь заражения и дозу. Температура инкубации играет также немаловажную роль. Из эмбрионов птиц чаще всего используют кур. Их организм до 13 дня отличается повышенной чувствительностью. Хорошо размножаются вирусы в желточном мешке, трахее и легких.

Независимо от пути заражения эмбрионы могут быть травмированы. По этой причине гибель эмбрионов в течение суток после заражения вирусов, ученые не расценивают, как особенную. Обычно для размножения вируса в эмбрионе необходима температура от 36 до 37 градусов. Но для некоторых вирусных клеток необходима температура 40 градусов и выше.

Размножаясь в организме эмбрионов вирусы могут приводить к гибели первых. Большую часть известных науке вирусов выращивают не только в организмах животных, но и в культурах клеток и тканей. В большинстве случаев для этих целей используют клеточные культуры на стекле. Суспензионные культуры используют очень редко. Адаптация вируса проходит легче к первичным культурам клеток, нежели к прививаемым. Для размножения человеческих вирусов лучше всего подходят клетки человека или почечные клетки обезьян.

Доза для вируса при заражении должна составлять от 0,1 до 0,001 пятидесяти процентов тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. При это объем вводимого материала должен быть невелик. Через пару часов адсорбируют вирус, только после этого в случае токсичности инокулят удаляют.

При размножении большинства вирусов наблюдаются цитопатические изменения. При дегенерации ¾ клеток в культуре наблюдают максимальное содержание вируса. Размножение вирусов, которые не обладают таким свойством, можно установить при помощи реакции гемадсорбции, путем проведения опытов на животных.

Большая часть вирусных клеток после размножения выходят в культуральную среду, другие же так и остаются связаны с клетками. Некоторые герпетические вирусы пересевают наравне с неповрежденными клетками. Это обусловлено тем, что при разрушении последних осуществляется их инактивация. В некоторых случаях взаимодействие вируса и клетки приводит к развитию хронической болезни.

Чтобы вырастить коронавирус человека, а также другие вирусы берут тканевые культуры. Чаще всего для этих целей используют ткани трахеи кролика. Понять о том, что вирус размножается можно по прекращению движения ресничек культуры ткани.

Нельзя забывать о том, что в культурах клеток и тканей могут быть вирусы и микоплазмы. Попасть туда они могут различным способом.

Для того, чтобы произошла адаптация вируса в искусственно созданных условиях, необходимо проведение нескольких пассажей. Чаще всего они последовательны при введении небольшого количества материала. Во время такой процедуры интенсивность культивирования вируса только растет. Адаптировавшись к одной системе, вирусы часто приобретают возможность размножаться в других системах. Те вирусы, которые выделены недавно, обладают повышенной пластичностью, нежели те, которые долго культивировались в других условиях.

Следствием культивирования вируса в искусственных условиях становится уменьшение их патогенности для естественных владельцев. Такое их свойство положено в основу вакцинации. Если условия культивирования неблагоприятны, то в результате процесса могут появляться дефектные вирусные частицы. В них может содержаться лишь некоторая часть генома. Существуют вирусы, которые в искусственной среде культивировать и вовсе нельзя. После нескольких пассажей их репродукция прекращается.

Вирусы сохраняют в особых условиях. Температура среды не должна быть меньше 4 градусов, а кислотность должна быть равна 7.0. При низкой температуре -70 и ниже вирусы сохраняются отлично. Для этого их помещают в плотно закрытые сосуды. При таких условиях хранения многие из них могут живут годами.

Вирус оспы и энтеровирус хорошо хранится при температуре -20 градусов. Замораживают их быстро. Для их сохранения к среде добавляют стабилизаторы, которые на каждый вирус действуют неоднозначно.

После лиофилизации вирусы могут жить на протяжении длительного промежутка времени. Стабилизаторы, которые применяют: молоко, пептон или куриный желток. Сохранение лиофилизированного вируса должно осуществляться в вакууме или нейтральном газе.

Вернуться назад