В процессе микробиологического исследования выделяют чистые культуры микроорганизмов, осуществляют их культивирование с последующим изучением свойств. Культуры, состоящие из микроорганизмов одного вида, называют чистыми. Их используют при проведении диагностических мероприятий в процессе выявления инфекционных заболеваний, определяя видовую и типовую принадлежность.
Культивирование микроорганизмов осуществляется с помощью специальных субстратов – питательных сред. Среды для культивирования, выращиваемые в искусственных условиях, позволяют отследить все процессы микроорганизмов – питание, дыхание и размножение.
Получить КП на питательные среды с нейтрализаторами антибиотиков для культивирования аэробов
Особенности питательных сред, используемых для культивирования
От качества питательной среды зависят результаты исследования. Для создания оптимальных условия для жизнедеятельности микробов, среды должны соответствовать определенным параметрам:
- Питательность. В их составе должны присутствовать все необходимые вещества, обеспечивающие легкую усваиваемость, а также удовлетворение потребностей в пище и энергии. В некоторых случаях в состав питательных сред специально добавляют витамины и аминокислоты, обеспечивающие необходимый рост клеток.
- Оптимальная концентрация водородных ионов. Для обеспечения необходимой проницаемости оболочки клеток.
- Изотоничность. Для поддержания осмотического давления в среде в соответствии с давлением внутри клетки.
- Стерильность. Для исключения посторонних микробов, которые могут препятствовать росту.
- Оптимальная консистенция.
- Окислительно-восстановительный потенциал.
- Унифицированность. Обеспечивает содержание постоянного количества ингредиентов.
Для удобства слежения за ростом культивируемых культур, среда должна быть прозрачной.
Питательные среды можно классифицировать по нескольким параметрам:
- Компонентный состав. По этому критерию среды делят на натуральные и синтетические. Для натуральных используют продукты животного и растительного происхождения. Для приготовления синтетических сред используют органические и неорганические соединения химически чистого типа.
- Уровень плотности. По консистенции среды делятся на жидкие, плотные и полужидкие. Для получения необходимой плотности используют агар-агар или желатин.
- Состав. По этому критерию среды делятся на простые и сложные.
- Назначение. Среды делятся на общеупотребительные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие.
Особенности состава питательных сред для культивирования
Основные компоненты любой питательной среды – соединения углерода и азота. На натуральных средах хорошо растут и развиваются многие микроорганизмы, так как они содержат большое количество необходимых ингредиентов. Но их редко используют для изучения физиологии обмена веществ, так как их состав сложен и непостоянен. Для этого удобнее и информативнее использовать синтетические среды.
Приготовление питательных сред
При приготовлении сред следует использовать строго чистую посуду, которая не содержит посторонних веществ – щелочей или окислов, а также ржавчины. Оптимально использовать эмалированные, стеклянные или алюминиевые емкости. При необходимости приготовления больших объемов сред используют специальные варочные котлы или реакторы. Перед началом приготовления посуду тщательно моют, вытирают и просушивают. Стеклянные емкости предварительно необходимо прокипятить в хлор водородной кислоте.
Важно! Посуду для приготовления питательных сред запрещено использовать для других целей.
Основные компоненты большинства питательных сред – это продукты животного и растительного происхождения. Для приготовления питательных бульонов используют мясную воду или перевары от кислотного или ферментативного гидролиза. Чаще всего используют панкреатический перевар Хоттингера, гидролизаты казеина и кормовые дрожжи. На их основе готовят различные среды.
Этапы приготовления питательных сред
Процесс приготовления питательных сред состоит из следующих этапов:
- Варка. Может осуществляться на открытом огне, на водяной бане, с использованием автоклава или варочного котла, которые нагреваются при помощи пара.
- Установление оптимальной величины pH. Выполняют с применением индикаторных бумажек. Прибор используемый для этой операции – потенциометр или компаратор, которые представляют собой штативы с отсеками для пробирок и набора стандартов pH. При этом в пробирках сравнивают цвета жидкостей с эталонным цветом.
- Осветление. Эта операция проводится, если в процессе приготовления среда становится мутной или темнеет. Для осветления можно использовать белок куриного яйца, смешанный с двойной порцией воды, который предварительно тщательно перемешивают и кипятят. Иногда для этих целей используют сыворотку крови.
- Разлив. Осуществляется в специальные пробирки, объемом 3-5 или 10 мл. Это могут быть также флаконы или колбы, специальные бутылки. Если для стерилизации сред используется температура выше 100°С, то их разливают в сухие чистые емкости. Если для стерилизации используется меньшая температура, то разлив осуществляют в стерильные емкости. Для разлива используют воронку, на конце которой есть резиновая трубка с зажимом Мора.Фильтрация. Проводят для жидких и расплавленных желатиновых сред. Для этого используют влажные фильтры на основе бумаги или материи. Агаровые среды труднее фильтровать из-за того, что их застывание происходит достаточно быстро. Вместо этого для агаровых сред чаще всего используют отстаивание, с расплавлением в автоклаве.
- Стерилизация. Режим стерилизации выбирают с учетом указаний к рецепту и в зависимости от компонентного состава. Примерная схема стерилизации приведена в таблице.
- Контроль. Стерильность контролируют, используя термостат. Для этого среду ставят в него на двое суток. При отсутствии при осмотре признаков роста среду считают стерильной и отправляют ее на химический контроль. Химический – следующий вид контроля, благодаря которому окончательно устанавливают pH. Его проводят в химической лаборатории. Следующий вид контроля – биологический, с помощью которого определяют питательные свойства среды.
| Среды | Режим стерилизации | ||
| аппарат | температура, давление | время | |
| Простые | Автоклав | 120 °C (1 атм) | 20 мин |
Сложные: 1) с углеводами, молоком, желатином | Автоклав с незакрытой крышкой или аппарат Коха | 100 °C (текучий пар) | 30—60 мин, 3 дня подряд (дробная стерилизация) |
| 2) белковые (сывороточные или яичные) с уплотнением | Свертыватель Коха (возможны два режима) | 80—85 °C | 1 ч, 3 дня подряд |
| 95 °C | 1 ч, однократно | ||
| 3) белковые жидкие | Водяная баня или инактиватор | 58 °C | 1 ч, 3—4 дня подряд |
Хранение сред осуществляется при комнатной температуре, в специально предназначенных для этого шкафах. Составы с кровью или витаминами хранят в холодильниках.
Принципы составления простых и сложных питательных сред
Нормальный рост микроорганизмов возможен только в определенной питательной среде, состоящей их конкретного набора компонентов, кроме того эти компоненты должны содержаться в особых пропорциях.
Рецепты простых сред
Изотонический раствор хлорида натрия. Готовится на основе 1 литра дистиллированной воды, смешанной с 9 граммами натрия хлорида. Смесь фильтруют, и устанавливают требуемый pH, после чего при необходимости стерилизуют при температуре 120°С в течение получаса.
Мясопептонный бульон. Мясную воду смешивают с 1% пептона и 0,5% х.ч. натрия хлорида. Далее осуществляют кипячение на медленном огне в течение 10-15 минут до полного растворения ингредиентов. Далее устанавливают требуемый pH, после чего повторно кипятят до момента выпадения осадка. После проведения фильтрации объем дополняют до первоначального и проводят стерилизацию при 120°С в течение 20 минут.
Бульон Хоттинтера. Для приготовления используют перевар Хоттингера, который разводят водой в 5-6 раз с учетом содержания аминного азота. В разведенный перевар добавляют 0,5% натрия хлорида, с последующим кипячении на слабом огне до полного растворения соли. Нужный pH устанавливают в уже остывшей среде, после чего проводят фильтрацию, разлив и стерилизацию в течение 20 минут.
Мясопептонный агар. В готовый бульон (на этапе до или после стерилизации) доливают 2-3% агар-агар с последующим кипячением. Готовят состав на слабом огне с постоянным помешиванием, пока агар полностью не растворится. Для приготовления можно использовать автоклав или аппарат Коха. При необходимости готовую среду можно осветлять, фильтровать или стерилизовать.
В полужидком агаре 0,4-0,5 % агар-агара.
Питательный желатин. Для приготовления используют готовый бульон, в который добавляют 10-15 % желатина. Смесь подогревают, но не кипятят, доводя желатин до полного расплавления, после чего жидкость разливают по стерильным емкостям и проводят стерилизацию с использованием текучего пара.
Рецепты сложных сред
Среды с углеводами. Основной бульон или расплавленный агар дополняют нужным количеством определенного углевода (около 0,1-2%). После того, как он полностью растворился, состав наливают в стерильную посуду и проводят стерилизацию текучим паром. После проведения контроля стерильности среду можно использовать для культивации.
Среды с кровью. Для их приготовления используют простые стерильные среды, в которые в асептических условиях добавлена дефибринированная кровь (до 30%). Среды на основе агара перед добавлением расплавляют и остужают до 45 градусов Цельсия.
Важно! Запрещено растапливать среды с кровью, во избежание изменения свойств состава.
Среды с сывороткой крови. Готовят также, как и предыдущие составы. В основную среду добавляют от 10 до 20% сыворотки без консервантов, которая предварительно инактивирована.
Среды с желчью. В состав простых сред добавляют желчь (10-40% от объема). После устанавливают нужный pH, проводят стерилизацию при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
Рассчитать стоимость питательных сред с нейтрализаторами антибиотиков для культивирования аэробов
Сухие среды
Выпускают также сухие среды, которые представляют собой порошки в флаконах. На их этикетках указываются правила приготовления составов. Это могут быть как простые, так и специальные среды, а также элективные и дифференциально-диагностические. Удобство сухих составов состоит в том, что они просты в приготовлении и могут использоваться даже в походных условиях. Они могут быть приготовлены из заменителей мяса.
Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.
Поделиться ссылкой:
