Методы определения чувствительности к антибиотикам

Точное знание чувствительности болезнетворных организмов к антибиотикам позволяет подбирать эффективную терапию, не тратя лишнее время на подбор лекарственных препаратов. На практике существует две основных группы методов:

• Диффузионные. Они могут проводиться при помощи Е-тестов или посредством применения дисков с антибиотиками.
• Разведения. В таком случае используется жидкая питательная среда (бульон) или агар.

Получить КП на анализаторы чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам

Диффузионные методы

Диффузионный метод с использованием дисков предполагает применение чаш Петри, в которые помещен агар. На его поверхность наносится бактериальная суспензия определенной плотности. После чего в них помещаются диски с  антибиотиком. В процессе диффузии формируется зона подавления роста организмов вокруг дисков. Далее емкости помещаются в термостат, где поддерживается температура 35-37 градусов по Цельсию. После инкубации, в течение ночи измеряют диаметр зоны вокруг диска, определяя значение в миллиметрах.

Выявление чувствительности с помощью Е-тестов проводится таким же способом. Только вместо дисков используются полоски Е-теста, на которые нанесены антибиотики в различных концентрациях, от минимальной до максимальной. На полоске предусмотрена эллипсовидная зона, позволяющая определить минимальную концентрацию антибиотика.

Диффузионные методы характеризуются простотой реализации, доступностью и могут быть выполнены в практически любой лаборатории. Чаще всего используется диффузионный метод с дисками, так как стоимость проведения такого исследования гораздо ниже, чем с применением Е-тестов.

Методы разведения

Они предполагают применение двойных последовательных разведений различных концентраций антибиотиков – от минимальной до максимальной. Антибиотики добавляются в жидкую среду на основе бульона или агар-агара. Полученный состав-суспензию вносят в жидкую среду. Инкубационный период в течение ночи предполагает поддержание температурного режима 35-37 градусов по Цельсию. При наличии роста микроорганизмов определяют, что данная концентрация антибиотиков недостаточна для их подавления. По мере увеличения концентрации интенсивность роста антибиотиков снижается. Минимальной подавляющей концентрацией (МПК), считается та, при которой визуально не определяется рост бактерий. Измерения проводятся в мг/л или мкг/мл.

Полученные количественные данные позволяют разделить микроорганизмы на несколько видов:

• Чувствительные.
• Умеренно резистентные.
• Резистентные.

Разграничение чувствительности по параметру резистентности проводится на основе пограничной концентрации антибиотика. Интенсивность чувствительности не постоянная величина и может изменяться.  Разработку и пересмотр стандартов проводят в специальных комитетах, например, в National Committee for Clinical Laboratory Standards – NCCLS. Стандарты этой организации признаются во всем мире и используются при проведении различных видов исследований.

Интерпретация результатов возможна с применением одного из подходов – микробиологического и клинического. В первом случае учитывают анализ параметров концентрация антибиотика, который подавляет бактерии. Во втором – проводят оценку антибактериальной терапии.

Чувствительные микроорганизмы

К такому типу относятся бактерии, которые характеризуются хорошим терапевтическим эффектом при лечении стандартными дозами антибиотиков. Деление на категории при чувствительности определяется на основе учета данных, полученных при анализе концентраций.

Резистентные микроорганизмы

К ним относят устойчивые бактерии, при лечении которых нет эффекта от антибиотикотерапии, даже при использовании доз в максимальных концентрациях. Эти механизмы характеризуются наличием механизмов резистентности.

Промежуточная резистентность

При наличии таких бактерий определяется различный терапевтический исход. Иногда при использовании антибиотиков в максимальных дозах может наблюдаться положительный эффект от использования антибиотикотерапии, особенно если препарат накапливается в максимальных дозах.

С микробиологической точки зрения, к таким типам относят субпопуляции, которые характеризуются МПК и диаметрами зон, расположенными между резистентными и чувствительными микроорганизмами. Эта интерпретация считается в некоторых случаях условной, так как не только от нее зависит результат действия на бактерии препарата.

Другие методы определения резистентности микроорганизмов

В некоторых ситуациях, когда важно оперативно и с максимальной точностью определить чувствительность микроорганизмов к тому или иному антибактериальному препарату, а данных по результатам обычной чувствительности недостаточно, используют экспресс методы или ускоренные способы определения.

Такие способы применяются для выявления минимальной бактерицидной концентрации (МБК). Этот параметр характеризует минимальную концентрацию антибиотика, которая in vitro способствует гибели до 99,9% микроорганизмов за определенный промежуток времени.

Данный МБК востребованы при использовании антибиотикотерапии с бактериостатическим воздействием, особенно в той ситуации, когда у определенной категории пациентов нет результата применения антибиотикотерапии.

Все существующие современные методы не позволяют с максимальной точностью и достоверностью спрогнозировать эффективность применения антибиотиков в том или ином случае при борьбе с инфекциями. На получаемые при таких исследованиях данные помогают оперативно и с большей точностью выбирать препараты для лечения и корректировать их дозы.

Чувствительные микроорганизмы не обладают механизмами резистентности и их применение позволяет добиваться положительного эффекта при использовании любых доз и концентраций. Бактерии с промежуточным уровнем резистентности находятся в пограничной зоне между резистентными и чувствительными микроорганизмами и их использование иногда оправдано в max дозах или там, где локализована инфекция с применением препаратов в больших концентрациях. Резистентные микроорганизмы даже при использовании максимальных доз не позволяют обеспечить эффекта от применения.

Возбудители гнойно-септических инфекций характеризуются высокой устойчивостью к антибиотикотерапии. В процессе лечения они даже могут менять свой уровень устойчивости, что требует использования дополнительных исследований для определения уровня чувствительности как в период назначения препаратов, так и в процессе терапии.

Классические варианты определения резистентности с применением диффузионных методов и методов разведения не всегда позволяют быстро получить результат. Обычно ответ получают в течение 18 часов, а к некоторых случаях и больше.

Раннее назначение этиотропной терапии позволяет повышать эффективность химиотерапии. Но назначение и выбор дозы определяется с помощью ускоренных методов, которые позволяют оперативно получить необходимые данные.

Разновидности

Для максимально быстрого определения чувствительности используются ускоренные методы (выделение чистых культур антибиотиков) и экспресс-методы (для определения антибиотикограммы возбудителей без выделения чистых культур).

Чувствительность к химиопрепаратам определяется в ускоренном режиме с получением результата в течение 2-6 часов. Ускоренные методы можно разделить на пять групп:

1. Определение ферментативной активности микроорганизмов. В этом случае используется мясо-пептонный бульон с глюкозой, в который добавляют определенные концентрации антибиотика. После в среду вносятся исследуемые микроорганизмы, те бактерии, которые являются устойчивыми к препарату, усваивают глюкозу, изменяя кислотно-щелочной баланс состава. Параметры изменений определяют с помощью цветовых индикаторов.
2. Определение изменений окислительно-восстановительных особенностей среды. Такой метод считается наиболее распространенным и популярным. Его использование предполагает применение биологических или химических редокс-индикаторов. Они позволяют выявлять чувствительность разных типов бактерий. Микроорганизмы, для которых характерна устойчивость к антибиотикам могут расти и размножаться в этой среде, снижая потенциал и изменяя цвет индикатора. При наличии чувствительных микроорганизмовцвет среды не меняется. Такими индикаторами чаще всего служат руазрин, суспензии с эритроцитами, водные растворы кровяной соли, метиленовый синий и т.д.
3. Цитоморфологическая оценка. Этот метод предполагает, что чувствительные к антибиотикам микроорганизмы в процессе пребывания 3-4 часа на питательных средах с химпрепаратами не образуют колоний, а их клетки не увеличиваются. При таком методе важно использовать в исследованиях специальные препараты или микрокамеры, с помощью которых можно определять рост клеток. Это делает его трудоемким и предполагает использование специальных средств оснащения.
4. Выявление изменений оптической плотности среды. Для этого метода используется нефелометр или спектрофотометр, позволяющие выявить изменение оптической плотности культур.
5. Применение сред с ростовыми стимуляторами. Для этого способа выявления используют специальные питательные среды, которые содержат ростовые стимуляторы, с помощью которых можно оперативно определить изменения в среде. Стимуляторами могут выступать кровь и глюкоза, гибереллин и т.д.

Экспресс-метод

Экспресс-метод, предложенный М.И. Леви, позволяет оперативно определить чувствительность к антибиотикотерапии микроорганизмов, возбуждающих гнойно-септические заболевания. Анализ проводится с помощью специальных цветных питательных сред. Вместе с ростом устойчивых к терапии микроорганизмов снижается pH состава и происходит смена цвета индикатора. Если в среде присутствуют чувствительные микроорганизмы, то она не меняет цвета.

Последовательность проведения исследований:

• Основу технологии составляет метод разведений.
• Антибиотики разводят в цветной среде, которая содержит 0,002% индикатора бромкрезолпурпурного и 0,5% глюкозы.
• Смена цвета индикатора происходит при росте микроорганизмов.
• Отсутствие смены цвета говорит о наличии чувствительных микроорганизмов.
• Для исследований используются планшеты из пластмассы.
• Антибиотики разводятся в лунках.
• В контрольных лунках присутствует только цветная питательная среда.
• С помощью ватных тампонов гнойное отделяемое из ран забирали и помещали в лунки с различными концентрациями антибиотика.
• После планшеты помещаются в термостаты, где они находятся до того, как питательная среда изменит цвет.

Рассчитать стоимость анализаторов чувствительности микроорганизмов

Еще один инновационный экспресс-метод предполагает использование реакции ДНК-ДНК гибридизации. При его использовании применяются ДНК-зонды, с помощью которых определяют микроорганизмов детерминантов, которые кодируют резистентность микробной популяции. На зонды наносят метки – ферментные, люминисцентные или радиоактивные. При такой технологии нет необходимости в выделении чистых культур, что позволяет значительно сократить период проведения исследований. Такой способ диагностики требует применения сложного оборудования и дорогостоящих реактивов, что значительно ограничивает возможность применения.

Экспресс-анализатор определения чувствительности к антибиотикам Юнона® Formula позволяет выявлять резистентность или чувствительность микроорганизмов в оперативном режиме. В оборудовании используется технология усиления гомогенной оптической среды, т.е. применяются специальные оптические датчики, которые устанавливаются в специальных флаконах. Культивация в таком анализаторе может проводится в беспрерывном режиме, а за счет автоматической системы распознавания исключены ошибки в результатах.

 

Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.

Поделиться ссылкой: